PROTOCOLO PARA DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICADA CONIFERALDEÍDO DESIDROGENASE EM RAÍZES DE MILHO (Zea mays L.)

Abstract

A biomassa lignocelulósica é formada principalmente pelos polissacarídeos e fenilpropenoides que compõem a parede celular. O ácido ferúlico (FA) interliga os polímeros da parede inibindo a atividade de hidrolases. O FA é sintetizado pela oxidação do coniferaldeído catalisada pelaconiferaldeído desidrogenase (CALDH). Neste trabalho relatamos o estabelecimento de um protocolo para determinar a atividade da CALDH. Sementes de milho (Zea mays L.) foram germinadas no escuro (72 h, 25°C). 25 plântulas uniformes foram mantidas em hidroponia por 24 h. 2 g de raízes frescas foram maceradas em tampão de extração. O homogeneizado foi centrifugado (2200×g, 30 min, 4°C) e o sobrenadante precipitado com sulfato de amônio 70%. O extrato foi centrifugado (15 min) e o pellet ressuspendido com tampão de extração foi considerado extrato enzimático bruto. A reação foi iniciada com adição do substrato e mantida a 40°C por 10 min. O produto da reação foi separado por HPLC usando-se uma coluna C18 em corrida isocrática de 1 mL min-1 MeOH:AcOH 6% (30:70, v/v). A técnica foi validada com 1 mM de sinapato, um indutor desta enzima. Os resultados sugerem que o protocolo é um método é simples, rápido e preciso para quantificar a atividade da CALDH, podendo ser usado para determinar os efeitos de tratamentos que interfiram na síntese de fenilpropenoides.